BioMarkDiag

CEEX 166/2006

CERCETARI PRIVIND DIAGNOSTICARE SI CONTROL UTILIZIND BIOMARKERI

UBB

>english version

PARTENERI: 

CO      Conf. dr. Monica Culea: director de proiect-UBB
P1       Lector Dr. Paraschiva Cherecheş-Panţa: responsabil proiect-UMF
P2       Conf. Dr. Adela Pintea: responsabil de proiect-USAMV
P3       Prof. Dr. Eugen Culea: responsabil de proiect-UTCN

REZUMATUL PROIECTULUI:

 Proiectul de faţă a avut ca obiective obţinerea de noi proceduri, rapide şi precise, neinvazive sau minim invazive de diagnosticare a unor boli grave, prin utilizarea unor metodologii şi tehnici avansate analizând biomarkeri sau amprenta metabolomică. S-a elaborat metoda de analiză a aminoacizilor minim invazivă din cantitate minimă de sânge (20 µl), monitorizarea de copii martori şi pacienţi diagnosticaţi cu fenilcetonurie (PKU). S-a elaborat metoda de analiză minim invazivă, utilizând spoturi (n=6) de 20 µl sânge din deget pe hârtie specială. Metoda de analiză minim invazivă s-a aplicat la un număr de 67 cazuri obţinându-se raport pentru fenilalanină faţă de tirosină de 0,70 (n=54) faţă de valori cuprinse între 2-16 pentru bolnavi PKU (n=13).
Testul cafeinei, metodă minim invazivă pentru diagnosticarea disfuncţiei hepatice. S-a lucrat cu aparatul Thermo Finnigan în cuplaj cromatograf de gaze cu spectrometru de masă (GC-MS. Metoda a fost validată în domeniul 0-20µg ml^-1  cafeină. Măsurătorile clinice s-au aplicat pe 34 copii spitalizaţi pentru disfuncţie hepatică şi martori au ar`tat deferenţe semnificative între pacienţi şi martori.
Procedura de extracţie şi analiză a acetonei din urină, sange, aer expirat a utilizat metoda de extracţie headspace şi SPME pentru determinarea acetonei în probe biologice. Metoda de analiză cantitativă a acetonei din fluide biologice este neinvazivă, precisă şi sensibilă în domeniul de interes abordat. Acetona din aer expirat s-a analizat utilizând saci din polietilenă Tedlar de 500 ml. Rezultatele obţinute pentru aerul expirat au fost cu trei ordine de mărime mai scăzute în aerul expirat faţă de urină sau sânge, de ordinul ng/ml.
Analiza  cantitativă a leukotrienei B4 prin GC-MS. Leucotriena B4 (LKB₄), marker neinvaziv pentru controlul inflamaţiei căilor respiratorii la copii cu astm, e exalată la nivel mai ridicat în astm faţă de martor. Colectarea condensului din aer expirat (EBC) s-a făcut într-o cameră de condensare. LKB₄ şi acidul arachidonic, standardul intern, au fost analizaţi prin SIM-GC-MS după derivatizare cu etilcloroformiat şi extracţie lichid-lichid. Ionii selectaţi au fost m/z 79 pentru derivatul acidului arachidonic şi m/z 69 si 81 pentru derivatul LKB₄, iar detecţia s-a facut în modul de lucru SIM. Valorile obţinute pentru LKB₄ au fost semnificativ mai mari la copii cu astm, de ordinul sutelor de pg/ml condens aer expirat, faţă de martori
Fractia de NO expirat şi controlul astmului la copii. A fost studiat un grup de 38 copii (63% baieti) cu vârste cuprinse între 4 şi 11 ani (6,5±1,6 ani) având astm de cel puţin 6 luni. S-a testat scorul testului de astm, NO şi FEV1 la copii la început şi după 4 săptămâni de terapie cu corticosteroizi inhalaţi. Studiul demonstrează că tratamentul de 4 săptămâni cu steroizi inhalaţi la copii a înbunătăţit atât scorul ACT şi fracţia exhalată de NO. Aceşti parametrii neinvazivi pot fi utili pentru monitorizarea tratamentului clinic.Diseminarea s-a facut prin publicatii şi comunicări în ţară şi străinătate, aplicare în clinici (39 comunicări ştiinţifice, 16 lucări publicate în reviste din ţară şi străinătate din care 8 cotate ISI şi o carte publicată în ţară).

Concluzii: Activităţile proiectului au condus la realizarea unor metode neinvazive sau minim invazive, precise şi sensibile, pentru determinarea cantitativă a a unor biomarkeri în urină, sânge, aer expirat, condens din aer expirat, pentru diagnosticare precoce a unor boli pumonare sau metabolice, corelate cu alte metode de investigaţie utilizate în clinici, în special pentru grupe sensibile de pacienţi, cum sunt nou născuţii şi copiii.

STADIUL ACTUAL AL PROIECTULUI:

• A fost elaborată şi validată metoda de determinare cantitativă a aminoacizilor pentru diagnosticarea bolilor de metabolism (PKU, MSUD); monitorizarea în clinica a spoturilor de sange (20µl) pentru diagnosticarea bolii metabolice PKU, MSUD.

   

• 

                              Spoturi de sange recoltate de la nounascuti (20µl)
   

• A fost elaborată şi validată şi aplicată în clinică metoda de diagnosticare a disfunctiei hepatice SIM-GC-MS (testul cafeinei) pentru diagnosticare precoce a cirozei şi hepatitei, la grupe sensibile, copiii şi femeile gravide.

• S-au identificat şi selectat biomarkeri pentru diagnosticarea neinvazivă din aerul expirat (headspace, SPME) comparativ cu biomarkeri din sange şi urină (headspace); metode de determinare a acetonei.

• S-a elaborat metoda de determinare neinvazivă din aerul expirat a NO pentru controlul şi tratamentul astmului bronşic la copii.

• S-a elaborat metoda de determinare neinvazivă din aerul expirat a leukotrienei B4 (LKB4) prin SIM-GC-MS.

• Rezultatele au fost valorificate în 16 articole publicate sau în curs de publicare şi 39 comunicări ştiintifice, precum şi în aplicatii clinice.

PUBLICATII:

Articole publicate in reviste din tara si strainatate necotate ISI:

1.      A. Iordache, M. Culea, M. Jimborean, A. Pintea, M. Chiriac, AMINO ACIDS CHARACTERIZATION BY ISOTOPIC DILUTION GC-MS, Journal of Environmental Protection and Ecology- JEPE, in press

2.       M. Culea, M. Popa, P. Cherecheş-Panţa, A. Leucuţa, M. Nanulescu, Clearance-ul cafeinei – metodă pentru evaluarea funcţiei hepatice, Pediatru.ro, 7, 48-50, 2007.

3.       M. Culea, O. Cozar, A. Pintea, ID-GC/MS as a tool for diagnosis of inborn errors of metabolism, Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine - seria Veterinary medicine, 2007, Vol. 64(1-2), pag. 116-120, Print ISSN 1843-5270, Electronic ISSN 1843-5378,

4.       M. Culea, O. Cozar, Spectroscopic methods for rapid diagnosis, Acta electrotehnica, ISSN 1841-3323, 48,4, 2007, 389-392.

5.       M. Culea, A. Iordache, M. Chiriac, C. Lehene, O. Cozar, Rapid diagnosis of cirrhosis by isotopic dilution gas chromatography-mass spectrometry, Acta electrotehnica, ISSN 1841-3323, 48,4, 2007, p.79-82.

6.       M. Culea, E. Culea, P. Chereches-Panta, R. Fechete, S. Rada, Biomarkers use in diagnosis of different diseases, Acta electrotehnica, ISSN 1841-3323, 48,4, 2007, p.75-79.

7.       M. Culea, O. Cozar, A. Iordache, ISOTOPIC DILUTION GC-MS FOR AMINO ACIDS DETERMINATION, 13 th International ICIT Conference proceeding PROGRESSE IN CRYOGENISC AND ISOTOPES SEPARATON, Ramnicu Valcea, 2007, p.49-52.

8.       M. Culea, M. Chiriac, E. Culea,  C. Lehene, A. Iordache, ID-GC-MS Diagnosis of metabolic disease, vol 17, Romanian Academy, http://www.biophysicsnet.ro/rjb/, Rom. J. Biophys, 2007, P.169-175

Articole 2008 cotate ISI :
1. M. Culea, R. Fechete, E. Culea, C. Craciun, O. Cozar, COMPARATIVE SPECTROSCOPIC METHODS FOR RAPID DIAGNOSIS, Rev Chimie, in press
2. M. Culea, P. Chereches-Panţa, M. Nanulescu, C. Mesaros, DIAGNOSIS OF HEPATIC DYSFUNCTION DISEASES BY ISOTOPIC DILUTION GC/MS, Rev. Chimie, in press
3. M.Culea, A. Iordache, O. Cozar, GC/MS DETERMINATION OF VOLATILE ORGANIC COMPOUNDS, Rev Chimie, in press
4. M. Culea, A. Iordache, C. Mesaros, AMINOACID PROFILES MONITORING FOR DIAGNOSIS, "Chemické listy" " Journal, 2008,102,s936-938
5. C. Mesaros, M. Culea, E. Culea,  DIAGNOSIS OF CIRRHOSIS BY GC/MS, "Chemické listy" Journal, 2008,102,s961-962
6. M. Culea, E. Culea, P. Chereches-Panta, A. Pintea, LEUKOTRIENE QUANTITATION BY GC-MS, "Chemické listy" Journal, 2008,102,s963-964
7. M. Culea, P. Chereches-Panta, A. Pintea, E. Culea, BIOMARKERS    DETERMINATION BY GC-MS, International Journal of Environmental Analytical Chemistry, in press

Cărţi publicate:
1. M. Culea, Spectrometrie de masa. Pricipii si aplicatii, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2008, 302 pag, 978-973-751-655-8