MetDNA - PN-III-P4-ID-PCE-2020-1292
Rezultate 2021
Prima etapă a proiectului a prevăzut îmbunătățirea metodologiei de achiziție a spectrelor SERS ale ADN-ului prin adsorbția acestuia pe suprafețe metalice prin intermediu adionilor. Metodologia îmbunătățită prin testări sistematice pe ADN genomic standard a fost aplicată pentru ADN extras din diferite linii celulare cu grad de metilare diferit. În acest mod, a fost comparată performanța spectroscopiei SERS în determinarea gradului de metilare al ADN-ului cu metoda standard, ELISA, factorul de corelație obținut fiind de 0.74. De asemenea, au fost dezvoltate metode de preprocesare și analiză statistică nesupervizată și supervizată a spectrelor SERS a ADN-ului genomic. Acuratețile totale obținute pentru modelele statistice supervizate au fost următoarele: 63.2 % pentru neural networks, 68.4 % pentru k-NN. 78.9 % pentru Naive Bayes și 89.5% pentru SVM. În cadrul activităților desfășurate, s-a optimizat metoda de detecție a oncometabolitului 2 HG prin adsorbția selectivă a acestuia pe suprafețe metalice prin intermediul cationilor. Spectrul oncometabolitului 2HG a fost obținut după activarea substartului metalic cu ioni de Ca2+.
Pentru a facilita adsorbția ADN-ului pe suprafețe metalice s-au folosit adioni specifici precum Cl-, Br-, I-. Spectrul Raman al unui coloid de argint uzual, de exemplu redus cu citrat (cit-AgNPs), blank, prezintă numai benzile Raman ale apei. Cu toate acestea, dacă adăugăm Ca(NO3)2, spectrul SERS al citratului este activat prin adsorbția specifică a citratului pe suprafața nanoparticulelor de argint, prin atomul său de O, așa cum este indicat de banda SERS de 230 cm-1, (spectrul (b)). Prin adăugarea secvențială de NaCl, KBr și KI în aceeași soluție la o concentrație finală de 10-3 M, ionii de halogenură înlocuiesc citratul de la suprafața nanoparticulelor datorită afinității lor mai mari pentru suprafața de argint și în consecință semnalului SERS de la Ag-Cl, Ag-Br și respectiv Ag-I este activat.
Figura 1. Adsorpția specifică a citratului, și a ionilor halizi în ordinea: Cl- – Br- – I- după adăugarea ionilor de Ca2+, monitorizată prin spectroscopia SERS.
Necesitatea prezenței ionilor halizi pentru adsorbția ADN-ului pe suprafețele metalice a fost testată prin spectroscopia Raman amplificată de suprafață (SERS). Figura 2. prezintă spectrul SERS al ADN-ului înregistrată într-un coloid cit-AgNPs, înainte și dupăa activarea acestuia cu Ca2+ și Cl-. ADN-ul genomic a fost amestecat cu cit-AgNPs în raport 1:1. Nanoparticulele au fost activate cu Ca2+, dar nu s-a observat spectrul SERS specific ADN-ului ci al citratului, surfactantul nanoparticulelor. În coninuare s-a adăugat Cl- în soluție, care a condus la adsorbția ADN-ului pe suprafața metalică fapt observat prin apariția benzilor SERS ale adeninei 730 și 1330 cm-1, citozinei 790 cm-1.
Figura 2. Spectrele SERS ale ADN-ului genomic achiziționate într-un coloid cit-AgNPs activat secvențial cu Ca2+ și Cl-.
Au fost testate diferite metodologii de achiziție a spectrelor SERS ale ADN-ului genomic standard și ADN genomic extras din celulele folosind un kit manual de extracție.
În urma studiului sistematic privind metodologiile de achiziție a spectrelor SERS a fost stabilită metoda optimă de achiziție a spectrelor SERS pentru determinarea gradului de metilare a ADN-ului. Semnalul optim al ADN-ului a fost observat pentru măsurătoarea în picătură a amestecului hya-AgNPs activate cu Ca2+ și ADN genomic standard. Fiecare spectru va fi în continuare reprezentat ca o media a 3 achiziții, 40 de secunde fiecare achiziționate cu o putere laser de 10 %.
Adsorbția ADN-ului extras din celule pe suprafețe metalice a fost testat prin marcarea ADN-ului cu un fluorofor și urmărirea semnalului fluorescent. Sybr Green I a fost folosit ca fluorofor pentru urmărirea adsobției ADN-ului pe suprafețe metalice. Sybr Green I se leagă de ‚minor groove’ ale ADN-ului dublu catenar și emiste semnal fluorescent doar în prezența acestuia. Măsurătorile de fluorescență au fost realizate prin excitarea cu linia laser 442 nm care cade în domeniu de absorbție al fluoroforului Sybr Green. Figura 3 prezintă adsorbția și desorbția ADN-ului de pe suprafața hya-AgNPs. Amestecând 5 µl hya-AgNPs cu 5 µl ADN genomic 25 ng/µl obținem un maxim de emisie la 535 nm caracteristic Sybr Green I legat de ADN. Prin adăugarea Ca2+ se observă o scăderea drastică a semnalului fluorescent datorită adsobției ADN-ului pe suprafața metalică. Adăugând în continuarea KI soluției, I- dezlovuiește ADN-ul de la suprafața metalică, acesta fiind din nou liber în soluție. Astfel, se observă din nou emisia fluorescentă a Sybr Green I legat de ADN-ul liber în soluție.
Figura 3. Adsorbția și desorbția ADN-ului pe suprafața hya-AgNPs urmărită prin semnalul fluorescent al Sybr Green I.
Pentru detecția ADN-ului genomic extras din culturi celulare au fost crescute 2 linii celulare cu grad de metilare diferite: HaCaT, cheratinocite nemuritoare aneuploide transformate spontan din pielea umană adultă, linie celulară benignă și NB4 linie celulară umană de leucemie acută, linie celulară malignă. Câte 5 probe din fiecare linie celulară au fost extrase folosind kit-ul de extracție manual. Concentratia de ADN din fiecare proba a fost masurata folosind NanoDrop. De asemenea, s-a realizat și o extracție din mediul de cultură celular, fără a conține nicio celulă folosită ca control negativ (CTRL), care nu conține ADN. Figura 4 prezintă media și deviația standard a spectrelor SERS ale ADN-ului extras din linia celulară HaCaT, NB4 și CTRL.
Figura 4. Spectrul SERS mediu și deviația standard a ADN-ului extras din linia celulară HaCaT, NB4 și CTRL.
Reproductibilitatea spectrelor SERS a fost testaă pentru ADN-ul extras din linia celulară NB4 (Figura 5). Un amestec hya-AgNPs activate cu Ca2+ și ADN din aceeași probă a fost pregătite și masurat folosind aceiași parametrii pe o perioadă de 2 ore.
Figura 5. Spectrele SERS repetate pentru ADN extras din linia celulară NB4 achiziționate pe o perioadă de 2 ore.
Optimizarea detecției selective a oncometabolitului 2-hidroxiglutarat (2HG) prin metoda SERS
- Adsorbția oncometabolitului 2HG la nano-suprafețe metalice în prezența ionilor Al3+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe3+.
- Detecția selectivă SERS a oncometabolitului 2HG
Adsorbția oncometabolitului 2HG a fost testată la suprafața smetalică de argint a nanoparticulelor sintetizate prin reducerea cu citrat cit-AgNPs. A fost achiziționat spectrul SERS al oncometabolitului 2HG adsorbit pe suprafața metalică de argint, mai exact cit-AgNPs) folosit diferiței cationi (figura 6).
Figura 6. Spectrul SERS al HGA adsorbit pe nanoparticulele de argint prin adioni de Ca2+ adaugati solutiei, Zn2+, Ca2+, și Al3+.
Doar Ca2+ conduce la apariția semnalului SERS a 2HG (837 și 1397 cm-1). În cazul Al3+ se observă doar semnalul SERS al citratului, surfactantul nanoparticulelor. Pentru Mg2+ și Zn2+ nu se observă amplificarea SERS.
